Michèle Rousseau a débuté sa carrière sur le terrain à la DRIRE Nord-Pas de Calais en qualité de Chef de la division environnement. Elle a rejoint successivement le Ministère de l'environnement pour s'occuper de déchets, puis celui de l'industrie où elle a occupé les postes de Directeur adjoint de la Direction de la sûreté des installations nucléaires, en charge du contrôle du parc nucléaire d'EDF.
Par la suite, elle a travaillé au sein de l'Agence Nationale pour la Valorisation de la Recherche (ANVAR), en qualité de Directrice générale adjointe, où elle a conduit les politiques d'aide aux projets innovants des PME, puis au sein du Ministère de l'économie, des finances et de l'industrie, en qualité de Directrice de la demande et des marchés énergétiques, avec comme missions centrales l'élaboration du nouveau cadre législatif et réglementaire dû à l'ouverture des marchés européens de l'électricité et du gaz et le développement des économies d'énergie et des énergies renouvelables.
Elle est ensuite revenue au Ministère de l'écologie et du développement durable, en qualité de Secrétaire générale, puis à partir de 2008, de Directrice, Commissaire générale adjointe au développement durable, en charge notamment de la mise en oeuvre du Grenelle de l'environnement (lois, évaluations, suivi de son exécution) au sein du Ministère actuel.